原理與用途
- 診斷上 PCR 主要用以取得足量 DNA 供定序或其他分析，以呈現突變、其他遺傳變化，或特定基因／傳訊 RNA (messenger RNA) 的存在。
- 機轉:設計一對與基因組 DNA(或 RNA 反轉錄成的 DNA)雜交的短序列引子 (primers),搭配高溫穩定的 DNA polymerase,經反覆退火 (annealing)、延伸 (extending)、熔解／變性 (melting/denaturing) 循環擴增兩引子間的 DNA。
- 可用於福馬林固定石蠟包埋 (formalin-fixed, paraffin-embedded) 組織萃取的核酸;但因起始材料已交聯與片段化,引子須設計擴增較短的 DNA 片段。
- PCR 高度彈性,可調整用以:偵測基因突變(鹼基對置換、insertions、deletions)、呈現融合轉錄本(基因融合)、呈現克隆性 (clonality)、呈現異型合子性遺失 (loss of heterozygosity)、偵測感染原的 DNA/RNA、偵測 messenger RNA 表現量。
突變偵測與各法敏感度
- 直接定序基因組 DNA:可偵測癌症點突變,如 melanoma 的 BRAF 或 NRAS;一般可偵測每 5 個細胞中 1 個帶突變者。
- 焦磷酸定序 (pyrosequencing):更敏感,針對精確突變可降至每 10 或 20 個細胞中 1 個。
- 等位基因特異性 PCR (allele-specific PCR):可在每 50 或 100 個細胞中僅 1 個時偵測已知點突變;應用例為偵測皮膚 mastocytosis 的 KIT D816V 突變(腫瘤細胞相對稀少時)。
- 數位微滴 PCR (digital droplet PCR):高敏感度,聚焦單一精確核苷酸變化。
- insertions/deletions:通常以 Sanger sequencing 偵測。
- 即時 PCR (real-time PCR):於擴增循環中間接觀察擴增子 (amplicon),可快速判定陽性或陰性。
RT-PCR 與融合基因偵測
- 將 RNA 反轉錄成 DNA,可特異性偵測染色體易位產生的融合基因,如 clear cell sarcoma、dermatofibrosarcoma protuberans。
- 特別有價值:正常組織與其他腫瘤無此易位,故無腫瘤時即無擴增產物。
- 由於兩基因斷點可發生在多種內含子,常需多對引子涵蓋所有可能易位型;且同一腫瘤可有不同融合(如 clear cell sarcoma 可為 EWSR1-ATF1 或 EWSR1-CREB1),需額外引子組。
- 造血系統惡性腫瘤:偵測融合轉錄本可監測周邊血或骨髓的微量殘存疾病 (minimal residual disease),作為腫瘤負荷替代指標,評估治療反應或早期偵測復發;未來或可應用於實體腫瘤。
其他應用與限制
- PCR 亦可偵測正常基因。一例為偵測前哨淋巴結中可能被組織學與免疫組化遺漏的黑色素細胞特異性 RNA;但此法最終無價值,部分因淋巴結內痣 (nodal nevi) 亦會被偵測到。
- 同一分子缺陷常宜有多種方法學並用,因適用情境不同、提供資訊略異(以 clear cell sarcoma 易位為例,見圖 2-30)。
圖 2-29：使用 RT-PCR 偵測融合轉錄本:反轉錄將 RNA 轉為 cDNA 再經 PCR 擴增。因基因組 DNA 大內含子內斷點近乎隨機、難以擴增,改用轉錄後已剪接、外顯子直接並列的 RNA,使兩不同基因外顯子的新生並列更易偵測。針對兩基因外顯子設計引子時,僅融合轉錄本 cDNA 會被擴增(正常組織中此等內含子不相鄰);產物具特定大小可於膠體上偵測,但須以直接定序等方法確認身分,並擴增管家基因 (housekeeping gene) 轉錄本以確保 cDNA 品質。
Fig. 2.29 Use of RT-PCR to detect fusion transcripts: this technique uses reverse transcription to convert RNA to cDNA that can then be amplified by PCR…
圖 2-30：偵測反覆性易位的多種模式。傳統核型分析以中期染色體展開、用分帶(染色)技術偵測易位及其他結構異常;FISH 用較不凝縮的間期染色體偵測重排或擴增;RT-PCR 可偵測融合 RNA 轉錄本所涉的精確外顯子。三者皆為呈現染色體易位的有效方法,但各適用於不同樣本類型並提供不同資訊。
Fig. 2.30 Multiple modalities for detection of recurrent translocations…