聚合酶連鎖反應 (Polymerase chain reaction, PCR)
在診斷情境中，PCR 主要用以取得足量的 DNA 以供定序 (sequencing) 或其他方法分析，主要目的在於呈現某一突變或其他遺傳變化，或呈現某一特定基因或傳訊 RNA (messenger RNA) 的存在。
PCR 是一項極具彈性的技術，可加以調整以：
- 偵測基因中的突變（鹼基對置換 (base pair substitutions)、插入 (insertions) 與缺失 (deletions)），
- 呈現新生的融合轉錄本 (novel fusion transcripts，即基因融合)，
- 呈現克隆性 (clonality)，
- 呈現異型合子性遺失 (loss of heterozygosity，即一個等位基因的遺失)，
- 偵測與感染性微生物相關的 DNA 或 RNA，
- 偵測傳訊 RNA 的表現量。
能特異性地擴增並偵測人類基因組中任一 DNA 片段，為許多診斷開啟了大門。在此技術中，設計一對能與兩段基因組 DNA（或由 RNA 反轉錄而成的 DNA）雜交的短 DNA 序列（稱為引子 (primers)），以擴增某一特定 DNA 區域。使用一種在高溫下穩定的 DNA 聚合酶 (DNA polymerase)，經由一系列退火 (annealing)、延伸 (extending) 與熔解／變性 (melting/denaturing) 循環，擴增兩探針之間的 DNA。此技術可用於自福馬林固定石蠟包埋 (formalin-fixed, paraffin-embedded) 組織萃取的核酸，不過引子必須設計成擴增較短的 DNA 片段，因為起始材料已因福馬林處理而發生交聯 (cross-linked) 與片段化 (fragmented)。
多種以 PCR 為基礎的技術可用以擴增 DNA 並進而測定其序列。直接定序基因組 DNA (direct sequencing of genomic DNA) 可偵測癌症中的點突變，例如 melanoma 中的 BRAF 或 NRAS。一般而言，此技術可偵測出每 5 個細胞中有 1 個帶有突變。更敏感的技術（如焦磷酸定序 (pyrosequencing)）可藉由針對精確突變的分析，將此比例降至每 10 或 20 個細胞中 1 個。等位基因特異性 PCR (allele-specific PCR) 可在每 50 或 100 個細胞中僅 1 個的情況下偵測出已知的點突變。此技術的應用之一為偵測皮膚 mastocytosis 中的 KIT D816V 突變，其腫瘤細胞相對於周圍正常組織可能相當稀少。數位微滴 PCR (digital droplet PCR) 也能提供高敏感度，並聚焦於單一精確的核苷酸變化。基因中的插入與缺失亦可被偵測，通常以 Sanger 定序 (Sanger sequencing) 進行。即時 PCR (real-time PCR) 可在擴增循環過程中間接觀察所需的 PCR 產物（擴增子 (amplicon)），並能快速判定陽性或陰性結果。
具有高比值且僅影響染色體臂部分區域的增益稱為擴增 (amplifications)。它們源自多個獨立事件（染色體斷裂與融合），這些事件在正向選擇 (positive selection) 下累積，通常是因為擴增子內所含的基因組區域含有一個致癌基因 (oncogene)，亦即一個為帶有該基因增加拷貝數之腫瘤細胞提供生長優勢的基因。
將 RNA 反轉錄 (reverse transcribing) 成 DNA，可特異性地偵測由染色體易位產生的融合基因 (fusion genes)，例如 clear cell sarcoma 或 dermatofibrosarcoma protuberans 所見者。此技術特別有價值，因為在無腫瘤時並無擴增產物，因為這些易位不存在於正常組織或其他腫瘤中（見圖 2.29）。由於易位事件所涉的兩個基因可在多種內含子（編碼蛋白質之外顯子片段間的非編碼 DNA 區域）發生斷裂，故常需要多對引子才能偵測所有可能的易位類型。此外，由於可能涉及多個基因，例如 clear cell sarcoma 可含有 EWSR1-ATF1 或 EWSR1-CREB1 融合，因此偵測這些情況亦需額外的引子組（見圖 17.18C）。在造血系統惡性腫瘤中，偵測融合轉錄本可用以偵測周邊血或骨髓中的微量殘存疾病 (minimal residual disease)，以測量腫瘤 DNA 作為腫瘤負荷量 (tumor load) 的替代指標，藉以評估治療反應或達成復發的早期偵測。此方法未來可能應用於實體腫瘤。
PCR 也可用以偵測正常基因。皮膚病理學中的一例為：嘗試偵測前哨淋巴結 (sentinel lymph nodes) 中可能被組織學與免疫組織化學篩檢遺漏的黑色素細胞特異性 RNA（反轉錄為 DNA）。最終此技術並無價值，至少部分原因在於存在淋巴結內痣 (nodal nevi)，此種痣亦會被此技術偵測到。雖然在研究領域中廣泛使用，其他以偵測基因表現為基礎的診斷方法很可能將隨時間演進。
擁有多種偵測各類分子缺陷的方法學常具優勢，因為它們適用於不同情境並提供略為不同的資訊。圖 2.30 即針對 clear cell sarcoma 中所存在的易位描繪此點。
圖 2-28：以陣列比較基因組雜交 (array comparative genomic hybridization) 偵測一例 acral melanoma 的 DNA 拷貝數變化：此圖顯示腫瘤對參考 DNA 之螢光強度比的 log2 值，依其基因組位置繪於 x 軸上。上方與下方的數字表示染色體。log2 比值為零對應正常拷貝數。如圖所示，多個相連的染色體區域顯示遺失與增益。箭頭對應第 11 號染色體 11q13 區間的擴增，該區間含有編碼 cyclin D1 的基因。
圖 2-29：使用 RT-PCR 偵測融合轉錄本：此技術利用反轉錄將 RNA 轉換為 cDNA，隨後可經 PCR 擴增。此步驟為必要，因為基因組 DNA 中通常很大的內含子區域內的斷點基本上是隨機的，使得以基因組 DNA 為模板來擴增此類大區域以辨識斷點極為困難。當基因被轉錄為 RNA 時，內含子在剪接 (splicing) 過程中被移除，而內含子（原文如此）被直接並列（圖 2.22C），使得來自兩個不同基因之外顯子的新生並列得以更容易被偵測。當針對易位所涉兩個基因各自的外顯子設計引子時，僅有融合轉錄本的 cDNA 會被擴增，因為這些內含子在正常組織中並不相鄰。此產物將具有特定大小並可在膠體 (gel) 上偵測，但應使用直接 DNA 定序或其他方法以確認其身分。擴增正常的管家基因 (housekeeping gene) 轉錄本則用以確保 cDNA 的品質。
圖 2-30：偵測反覆性易位的多種模式。傳統核型分析使用中期染色體展開，藉由分帶（染色）技術偵測易位及其他結構性遺傳異常。FISH 使用較不凝縮的間期染色體以偵測重排或擴增。RT-PCR 可偵測融合 RNA 轉錄本中所涉的精確外顯子。每一種皆為呈現染色體易位的有效方法，但各自適用於不同的樣本類型並提供不同的資訊。