引言
免疫組織化學 (immunohistochemistry) 是黑色素瘤 (melanoma) 診斷中組織學的重要輔助工具，尤其適用於無色素型 (amelanotic)、上皮樣 (epithelioid) 與梭形細胞 (spindled cell) 變異型，以及將它們與未分化癌 (undifferentiated carcinoma) 及間葉性腫瘤 (mesenchymal tumor) 做鑑別。由於特異性與敏感性的問題，在這類疑難病例中審慎地使用兩種、甚至三種「melanoma markers（黑色素瘤標記）」是明智的。將這些標記作為觀察多種分化方向之 panel 的一部分使用，在實務上也很有用，例如納入 keratins 以排除上皮性腫瘤。在形態學上具挑戰性的病例中，一組染色（panel）依其反應或不反應的模式來支持最終診斷，是非常有幫助的。免疫組織化學的角色在於提供支持性資料，幾乎不應、也很少應作為達成黑色素瘤診斷的唯一依據。
S100 protein 仍是黑色素瘤免疫組織化學診斷的標竿 (yardstick)。雖然現今已有相當多新的標記可用，但目前尚無任何單一標記能與 S100 protein 相提並論。然而，S100 protein 缺乏特異性，且存在極為例外的 S100 protein 陰性黑色素瘤，這些幾乎全為轉移性病灶。在診斷仍有疑慮的病例中，運用一整組 (battery) 免疫組織化學標記可能極具價值。
A
S100 protein 是一種鈣結合性的 F-band 蛋白，由腦組織分離而得。它在 94–100% 的原發與轉移性黑色素瘤中呈現程度不一的陽性。除黑色素細胞 (melanocytes) 外，Schwann cells、肌上皮細胞 (myoepithelial cells)、脂肪細胞 (adipocytes)、軟骨細胞 (chondrocytes)、巨噬細胞 (macrophages)、Langerhans cells，以及源自上述細胞的腫瘤，皆會表現 S100 protein。Langerhans cells 的染色有時會造成問題，尤其在評估表皮內黑色素細胞擴散範圍時。在此類情況下，加做 MITF、SOX10、HMB-45 或 MART-1 可能有所幫助。S100 protein 也可能在若干乳癌 (breast carcinoma) 與未分化癌中表現。最常使用的抗 S100 抗體，是一種針對由牛腦純化之 S100 protein 的純化兔多株抗體 (rabbit polyclonal antibody)。此家族成員超過 20 種，其中許多已有單株抗體 (monoclonal antibodies) 可用。雖尚未在大型系列研究中確立，但在鑑別診斷中，這些 isoforms 在黑色素瘤與其他傳統上 S100 protein 反應性腫瘤之間，可能具有某種選擇性。
B
HMB-45 與細胞質內的前黑色素小體醣蛋白 gp100 (premelanosome glycoprotein gp100) 反應，敏感性低於 S100 protein。它在 80–86% 的轉移性黑色素瘤與 90% 至 100% 的原發性腫瘤中表現。然而，其表現往往較 S100 更為局灶性 (focal)。在梭形細胞變異型中敏感性下降，且在 desmoplastic melanoma 中通常為陰性（見下文）。良性痣 (banal nevi) 的接合部 (junctional) 與淺層真皮成分也會與 HMB-45 反應，但較深層的真皮痣細胞 (dermal nevus cells) 一般為陰性。此差異性染色模式可能有助於確認與黑色素瘤相關的既存良性痣細胞，尤其有助於將其與 small cell 及 nevoid melanoma 做區分——後兩者在最深層的細胞巢中典型呈斑塊狀 (patchy) 陽性（圖 26-54）。極為重要的是須記得：當黑色素細胞帶有色素 (pigmented) 時，此模式即喪失，因為帶色素的黑色素細胞對 HMB-45 呈陽性。發育不良痣 (dysplastic nevi) 也會被類似地標記。藍痣 (blue nevi) 與深穿透性痣 (deep penetrating nevi) 同樣為 HMB-45 陽性。Spitz nevi 常在病灶的淺層呈 HMB-45 陽性，且此陽性通常（但絕非總是）會隨深度而消失。此一發現可能有助於將其與 spitzoid melanoma 做區分，後者的染色典型遍及整個腫瘤。雖然 HMB-45 比 S100 protein 更具特異性，但它也會與血管周上皮樣細胞腫瘤群 (perivascular epithelioid cell tumors, PEComas) 反應，包括 angiomyolipoma、lymphangiomyomatosis 及肺之 clear cell sugar tumor。
除黑色素瘤外，亦標記 Sertoli cell 與 granulosa cell 腫瘤，以及 PEComa 群病灶包括 angiomyolipoma、lymphangiomyomatosis 與肺之 clear cell sugar tumors。其在上皮樣黑色素瘤中的敏感性與 S100 protein 相近，但在梭形細胞腫瘤中敏感性較低，且通常不在 desmoplastic 變異型中表現。一項研究顯示有證據指出，MART-1 表現降低與腫瘤厚度增加、無病存活期 (disease-free interval) 縮短及病人死亡率上升相關。MART-1 表現亦曾於複合痣 (compound)、真皮痣 (dermal nevi) 及 Spitz nevi 中被證實，但神經化變異型 (neurotized variants) 例外。
MART-1 (Melan-A) 是一種黑色素小體分化抗原 (melanosomal differentiation antigen)，可被自體細胞毒性 T 細胞 (autologous cytotoxic T cells) 辨識。某些針對此蛋白製備的抗體（例如 A103）會標記多種病灶，包括腎上腺皮質 (adrenocortical)、Leydig cell。
抗酪胺酸酶抗體 (antityrosinase antibody，例如 T311) 的敏感性似乎低於 S100 protein、HMB-45 或 Melan-A (A103)。它似乎不會標記 desmoplastic melanoma。有些人會使用 HMB-45、MART-1 與抗酪胺酸酶抗體的混合液 (cocktails)，以提高偵測黑色素細胞分化的敏感性。
Microphthalmia transcription factor (MITF) 是一種轉錄調節因子，對 tyrosinase 的表現至關重要。它在痣與上皮樣黑色素瘤中呈強陽性。在梭形細胞與 desmoplastic 變異型中敏感性降低。Spitz nevi 與神經化的良性痣 (neurotized banal nevi) 表現減少。MITF 的特異性偏低，這限制了它在鑑別黑色素細胞病灶之擬態 (mimickers) 上的用途。其主要用途在於評估表皮內黑色素細胞，因為染色位於細胞核 (nuclear)，而表皮內其他細胞對此標記不呈陽性。
單株抗體 SM5-1 是以扣除式免疫接種流程 (subtractive immunization protocol) 利用人類黑色素瘤檢體所製備，可結合 fibronectin 的一種變異體。最初的報告指出其敏感性與 S100 protein 相近，且對其他傳統上 S100 protein 反應性病灶具有更佳的特異性，但此抗體亦會與肝細胞癌 (hepatocellular carcinoma) 及乳癌細胞反應。此抗體並未廣泛用於臨床診斷。
SOX10 是一種轉錄因子，為黑色素細胞的關鍵調節者。針對它製備的抗體代表了黑色素細胞與 Schwann cells 以及源自神經嵴 (neural crest) 之腫瘤的另一種標記。雖然它缺乏特異性且會染上其他細胞，但在與軟組織腫瘤 (soft tissue neoplasms) 相關的鑑別診斷中，其敏感性與 S100 protein 相當，而特異性更高。它在 desmoplastic melanoma 中也很有用，不過在疤痕 (scars) 中亦曾觀察到表現。它已被廣泛用作黑色素瘤的敏感標記，常與其他黑色素細胞標記合併使用。有人提出，在判定慢性日光受損皮膚 (chronically sun-damaged skin) 中黑色素細胞密度時——其他標記在此會出現具誤導性的偽陽性率——SOX10 比其他黑色素細胞標記更具特異性。亦有人提出其在前哨淋巴結 (sentinel lymph nodes) 評估中的角色。
1329 Immunohistochemistry of melanoma
要將新標記納入臨床實務作為黑色素瘤的標準，門檻很高。所有抗體都有一個自然歷程：隨著研究的腫瘤類型增加，其特異性會逐漸下降，而新抗體在此曲線上的進程不如舊抗體深入，若單獨使用這些新試劑，便有誤判的可能。
黑色素瘤細胞可表現上皮性標記，包括 keratins、EMA 與 CEA。keratin（尤其是低分子量者）在無論冷凍切片或石蠟包埋切片中，可在多達 10% 的黑色素瘤中被偵測到。若使用多株抗體，常會遇到 CEA 陽性。轉移性病灶比原發性腫瘤更常顯示此類異常 (aberrant) 染色模式。只要在抗體 panel 中納入 S100 protein 及／或其他 melanoma markers，便不太可能遭遇診斷困難。SMA 與 desmin 極少在黑色素瘤中表現，但 desmoplastic 變異型例外——如同多數梭形細胞腫瘤，其 SMA 可被偵測到程度不一的陽性。一項在 desmoplastic melanoma 中對 S100 protein 與 SMA 進行雙重標記 (dual labeling) 的研究指出，SMA 的反應性可能位於伴隨的基質肌纖維母細胞 (stromal myofibroblasts)。
黑色素瘤細胞可在 80% 或以上的腫瘤中表現組織細胞性標記 (histiocytic markers)，例如 CD68 (KP1)。Mac 387 與 α1-antitrypsin 亦可能為陽性。這具有特別的意義，因為區分腫瘤細胞與組織細胞 (histiocytes)——尤其在前哨淋巴結檢體中——有時相當棘手。此外，要區分氣球細胞黑色素細胞病灶 (balloon cell melanocytic lesions) 與黃瘤性浸潤 (xanthomatous infiltrates)，可能需要免疫組織化學的確認，尤其在看不到殘存可辨認的黑色素細胞成分時。在此類情況下，黑色素細胞標記的陽性顯然具有重大的診斷重要性。
有越來越多被認為具預後價值的免疫組織化學標記 (prognostic markers)。其中多數缺乏將該標記與特定結果（如黑色素瘤特異性死亡率）連結、並輔以風險比 (hazard ratios) 的適當檢力 (appropriately powered) 完整多變量分析 (multivariate analysis)，也未如 NCI-EORTC 的 REMARK (Reporting recommendation for tumor MARKer prognostic studies) 指引或 AJCC 腫瘤標記預後研究之精準醫療報告建議所推薦那樣完整描述所使用的方法。其中較有用者於下文極簡略地討論。這些標記中鮮少有達到例行應用於臨床檢體所需驗證程度者；幾乎全部都是在具有轉診偏差及其他偏差的回溯性世代 (retrospective cohorts) 中報告。使用多種標記並施以嚴謹的量化方法具有效力，能區分不同的預後族群。下文討論的標記主要用於在純粹組織學依據上難以判定的相對少數病例中，協助支持黑色素瘤或痣 (nevus) 的診斷。
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Ki-67 (MIB-1) 在區分良性黑色素細胞痣（包括 Spitz nevi）與黑色素瘤上，是特別有價值的輔助工具。在痣中，少於 5% 的細胞核呈陽性（且這些通常位於真皮成分的最淺層），而在黑色素瘤中則有 25% 或以上的細胞被標記（圖 26-55 與圖 26-56）。其在預測生物學行為上的角色具有爭議；因此，雖然早期研究認為厚腫瘤中表現增加與較差的存活相關，
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1330 Melanoma
但較近期則有人主張，在薄腫瘤（< 1.5 mm）中表現增加具有更大的意義。另一項研究指出，MIB-1 反應性增加是一個與腫瘤厚度無關、就疾病特異性存活 (disease-specific survival) 而言的不良預後因子。顯然，核 MIB-1 反應性的程度與有絲分裂率 (mitotic rate) 之間存在比例關係，雖非完全精確。有絲分裂率是黑色素瘤結果的重要決定因素，不過在 AJCC 第 8 版分期系統中，它已不再主導分組。如何將 Ki-67 反應性與有絲分裂率相關聯，仍在持續發展中。Ki-67 表現增加亦與 p53 protein 過度表現及 p16 缺失相關（見下文）。
圖 26-54：Melanoma：此腫瘤發生於良性痣 (banal nevus) 的背景之上。(A) 比較嗜伊紅性、多形性的腫瘤細胞與小型嗜鹼性的痣細胞；(B) melanoma 細胞為 HMB-45 陽性；痣細胞為陰性。 (Fig. 26.54 Melanoma: this tumor has arisen in a background of a banal nevus. (A) Compare the eosinophilic, pleomorphic tumor cells with the small basophilic nevus cells; (B) the melanoma cells are HMB-45 positive; the nevus cells are negative.)
圖 26-55：Melanoma：此腫瘤（視野右側）發生於先天性痣 (congenital nevus，視野左側) 的背景之上。 (Fig. 26.55 Melanoma: this tumor (right side of field) has arisen in a background of a congenital nevus (left side of field).)
圖 26-56：(A, B) Melanoma：melanoma 顯示非常旺盛的 MIB-1 表現，而痣則完全陰性。 (Fig. 26.56 (A, B) Melanoma: the melanoma shows very brisk MIB-1 expression, and the nevus is completely negative.)
包括某些經美國 FDA 核准的伴隨式診斷 (companion diagnostics)，但目前在黑色素瘤使用免疫檢查點抑制劑 (immune checkpoint inhibitor) 治療並不要求此類檢測。事實上，即使黑色素瘤完全缺乏膜性 PD-L1 表現，仍可對 PD-1 (CD247/programmed cell death protein 1) 抑制劑產生反應。多數 PD-L1 抗體在黑色素瘤及其他腫瘤中的染色輪廓也十分相似。已有人提出並在臨床試驗及例行實務中使用特定的評分方法。亦可對黑色素瘤中的 CD8 陽性 T 細胞 (CD8-positive T-cells) 進行染色，較高的染色程度與免疫腫瘤學 (immuno-oncological) 治療反應可能性的增加相關。已有人提出評分這些浸潤的方法，但在例行臨床實務中尚未廣泛採用。這些生物標記方法主要用於轉移性疾病，且其與治療反應的相關性並不完美。這是一個活躍的研究領域，許多基因體及其他病人因素也已被與病人反應相連結。目前臨床實務中，並未使用伴隨式免疫組織化學方法於黑色素瘤的 CTLA-4 (CD152) 抑制劑。抗 CTLA-4 治療有時會與 PD-1 抑制劑合併使用。PD-L1 表現可協助判斷黑色素瘤應採用 PD-1 單一療法或合併療法。隨著免疫腫瘤學擴展至若干新興的新型藥物，例如 IDO1、LAG-3 等抑制劑——這些蛋白標靶的表現可能與治療療效相關——此領域的進一步工作很可能會產生更多相關的生物標記。
Phosphohistone H3 (PHH3) 直接辨識有絲分裂相 (mitotic figures)，而非如 MIB-1 般辨識細胞週期，可協助更客觀地判定與結果相關的有絲分裂率。在提高有絲分裂率偵測的敏感性時必須謹慎，因為大多數資料是以較不敏感、但目前為黃金標準的 H&E 染色顯微鏡偵測所取得，否則可能造成預後的不當高估。
Bcl-2 在正常黑色素細胞及多種痣中強烈表現，包括良性 (banal)、先天性 (congenital)、Spitz、藍痣 (blue) 與發育不良 (dysplastic) 變異型。雖然文獻結果有些不一致，但有人指出表現降低與黑色素瘤相關，尤其是轉移性病灶。同樣地，在疑難的 spitzoid 病灶中，強烈表現可能傾向支持良性的診斷。Bcl-2 下調 (downregulation) 已被認為與黑色素瘤進展相關。以自動化評估免疫螢光免疫組織化學 (immunofluorescent immunohistochemistry) 在原發或轉移病灶中評估時，高 bcl-2 與改善的疾病特異性結果相關。然而，依我們自身的經驗，bcl-2 在黑色素瘤中呈陽性的頻率與在良性痣中一樣高，因此在疑難病例中價值不大。
Cyclin D1 可能有助於區分良性痣與 nevoid melanoma，或黑色素瘤內的痣性成分。其遍及黑色素瘤全層厚度的表現，有報告高達 60% 的病例；而在痣中染色可能缺失或僅限於淺層的偶發細胞。Cyclin D1 反應性增加可能與其編碼基因座 (genetic locus) 的擴增 (amplification) 相關。淺表黑色素瘤中高量的 cyclin D3 已被發現與早期復發及存活降低相關。此關於 cyclin D3 的發現尚需進一步確認。有趣的是，cyclin D1 可能較多與 CDK4 互動，而 cyclin D3 較易與 CDK6 互動，顯示這兩種 cyclin D isoforms 具有不同的功能。