引言
- 特定 DNA 區域（往往含有特定的目標基因）的增加 (gains) 或喪失 (losses),可提供診斷上的洞見。
承接前述:EB 之超微結構與分子診斷補述
- 針對 EB 各型態所牽涉之標的蛋白,已發展出一組抗體（其中多數已可商業取得）,這已使穿透式電子顯微鏡 (transmission electron microscopy) 作為 EB 診斷工具的重要性下降。
- 然而,超微結構分析 (ultrastructural analysis) 在確認裂開平面 (plane of cleavage) 以及確立某些顯性型 EB (dominant forms of EB) 的診斷上仍有其用處。例如,圖 2.17B 所示新生兒的皮膚,對所有診斷探針皆顯示正常強度的基底膜帶反應性,但穿透式電子顯微鏡（圖 2.21）卻辨識出離散的張力絲團塊 (clumps of tonofilament) 與基底角質細胞溶解 (basal keratinocyte cytolysis),此為廣泛型重度體染色體顯性單純型 EB (autosomal dominant EB simplex) 的特徵。
- 然而,對於隱性型 EB,皮膚免疫標記 (skin immunolabeling) 已成為最重要的診斷方法。特定蛋白染色的減少或缺失可提供快速診斷,亦可作為辨識其潛在致病性突變所在編碼基因（一個或多個）的方法。
- 因此,皮膚切片的發現（組織學與免疫組織化學兩方面）可直接指引分子篩檢檢測,其中多數為以 PCR 為基礎或以次世代定序 (next-generation sequencing, NGS) 為基礎的檢測。
- 然而,對於顯性型 EB,病人皮膚的免疫組織化學可能與正常對照皮膚無法區別,因此 DNA 的 Sanger sequencing 常較皮膚切片分析更受偏好,作為初步的診斷檢查。
- 事實上,DNA 定序是診斷最常見型 EB——局部型單純型 EB (localized EB simplex)（水疱主要分布於手與足,占所有 EB 病例的 > 70%）——的最佳方法。
- 此外,EB 的診斷正日益採納 NGS 技術,包括全外顯子定序 (whole exome sequencing) 與選定的基因套組 (selected gene panels),作為主要的診斷工具。此分子資訊隨後可用於遺傳諮詢 (genetic counseling)、帶因者篩檢 (carrier screening),以及在有指徵時進行以 DNA 為基礎的產前檢測 (prenatal testing)。
- 儘管如此,皮膚切片診斷對 EB 的一項明顯優勢在於診斷時程:皮膚免疫組織化學可在 2 天內 (within 2 days) 完成,因此在可預見的未來,皮膚切片很可能仍是 EB 診斷的關鍵環節,尤其是在診斷 EB 新生兒方面。
等位基因失衡 / 雜合性喪失 (Allelic Imbalance / Loss of Heterozygosity, LOH)
- 等位基因 (allele) 是指特定遺傳基因座 (genetic locus) 或一段 DNA 區域（如一個基因）的變異型。
- 偵測等位基因失衡 (allelic imbalance) 或雜合性喪失 (loss of heterozygosity, LOH) 是一種可在石蠟包埋材料中偵測特定等位基因之缺失或增加的方法。這通常對應於特定目標基因的區域。
- 此方法利用 PCR 擴增帶有常見多型性 (common polymorphisms) 的小型基因組片段,因而這些片段在個體中有高度可能存在兩種不同變異型（等位基因）。理想情況下,這些變異型大小不同,以便能輕易於電泳膠 (electrophoretic gel) 上偵測;若無法做到,則可使用 DNA 定序。
- 唯有當病人正常組織中存在兩種不同等位基因時,此技術才具資訊價值。若在腫瘤組織中只偵測到其中一個等位基因,或更常見地偵測到某一等位基因大量過剩（因腫瘤細胞中混有正常組織）,即暗示存在失衡（一個等位基因的喪失）。更細緻的分析可區分出哪些屬於真正的喪失 (true losses)。
- 反覆出現喪失的位點,通常是含有腫瘤抑制基因 (tumor suppressor genes) 的區域。此方法可偵測到傳統染色體核型分析 (chromosomal karyotype analysis) 無法顯示的喪失,且可輕易應用於福馬林固定石蠟包埋 (formalin-fixed, paraffin-embedded, FFPE) 組織。
- LOH 分析的限制包括:它對正常（基質, stromal）細胞的污染相當敏感,當這類細胞量增加時,可能難以判定某一等位基因是否確實喪失。另一項缺點是,它無法判定該失衡究竟是由一個標記的喪失、抑或另一個標記的複製數增加 (copy number increase) 所造成。
圖 2-21:Dowling-Meara 型單純型 EB（即圖 2.17B 所示病例）皮膚的穿透式電子顯微鏡 (transmission electron microscopy):在基底角質細胞 (basal keratinocyte) 細胞質內,角蛋白絲 (keratin filaments) 凝聚並形成團塊,且在緊鄰真皮-表皮交界上方處發生細胞溶解 (cytolysis)。(Bar = 1 µm.) (Transmission electron microscopy of skin in Dowling-Meara EB simplex)