章節導言
本章作者：Pratistadevi K. Ramdial、Boris C. Bastian、Jeffrey P. North、John Goodlad、John A. McGrath 與 Alexander J. Lazar。
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本章涵蓋之主題包括：檢體固定、取材/送檢 (grossing/put-through)、處理、包埋與切片；常規與「特殊」染色 (Routine and ‘special’ stains)；免疫組織化學技術 (Immunohistochemical techniques)；免疫組織化學技術與疑難排解 (troubleshooting)；免疫螢光 (Immunofluorescence)；電子顯微鏡 (Electron microscopy)；皮膚的冷凍切片檢查 (Frozen section examination of skin)；皮膚病理學中的診斷性細胞病理技術 (Diagnostic cytopathological techniques in dermatopathology)；遺傳性皮膚疾病的診斷 (Diagnosis of inherited skin diseases)；分子技術 (Molecular techniques)；染色體核型分析 (Chromosomal karyotyping)；等位基因不平衡 (Allelic imbalance)；螢光原位雜交 (Fluorescence in situ hybridization, FISH)；比較性基因體雜交 (Comparative genomic hybridization, CGH)；聚合酶連鎖反應 (Polymerase chain reaction, PCR)；次世代定序 (Next-Generation Sequencing, NGS)；淋巴瘤的診斷 (Diagnosis of lymphomas)；皮膚淋巴樣浸潤的 PCR 分析 (PCR analysis of cutaneous lymphoid infiltrates)；皮膚淋巴增生性病變中的 T 細胞受體基因重排 (T-cell receptor gene rearrangement in cutaneous lymphoproliferations)；皮膚淋巴增生性病變中的 IG 基因重排 (IG gene rearrangement in cutaneous lymphoproliferations)。
檢體固定、取材/送檢、處理、包埋與切片
固定 (fixation) 的目的在於維持病灶特徵的清晰與一致，並將組織保存於適合一系列染色與輔助組織病理技術的最佳狀態。組織處理過程中所採用的大多數固定方法，都依賴於將組織以液態試劑進行化學固定 (chemical fixation)。組織固定亦可透過物理方法（加熱、微波、冷凍乾燥及冷凍置換 (freeze substitution)）和／或化學方法（凝固劑 (coagulant) 與交聯劑 (cross-linking)）來達成。最常使用的固定劑為 pH 介於 7.2–7.4 之間的 10% 中性緩衝福馬林溶液 (10% neutral-buffered formalin solution)。此溶液可避免組織切片中形成福馬林色素 (formalin pigment)。固定品質受以下因素影響：
- 檢體的大小，
- 固定的持續時間與溫度，
- pH 值，
- 濃度，
- 滲透壓 (osmolality)，
- 固定劑的離子組成以及固定劑中所含的添加物。
組織處理 (tissue processing) 是指一系列步驟，用以去除切片組織中可萃取的水分，以確保獲得最佳診斷品質的切片。這些步驟包括固定、脫水 (dehydration)、透明化 (clearing)、滲透 (infiltration)，以及在支撐基質 (support matrix) 中進行包埋 (embedding)。使用手動與自動化組織處理皆可達成此目標，包括：
- 旋轉式處理機 (carousel-type processors)，
- 自含式真空滲透組織處理機 (self-contained vacuum infiltration tissue processors)（圖 2.2），
- 微波組織處理 (microwave tissue processing)。在大多數實驗室中，隔夜處理流程是常規做法。然而，微波輔助組織處理可使處理時間縮短至 1–2 小時。脫水試劑促進組織中未結合水分與含水固定劑的移除。透明化試劑作為脫水溶液與滲透溶液之間的中介，可與兩者互溶。石蠟 (paraffin) 是最常用的滲透與包埋介質，適用於大多數的常規與特殊染色。皮膚切片在包埋過程中必須遵守的重要原則是：皮膚樣本的方向應在切片 (microtomy) 過程中對刀片提供最小的阻力（圖 2.3）。皮膚切片通常以與表皮 (epidermis) 成直角的平面切取，以盡量減少表皮的壓縮與變形。
福馬林固定 (Formalin fixation) 的速率約為每小時 1 mm。固定劑的體積理想上應至少為檢體體積的 10 倍。大型檢體（如腫瘤）可能需要切成 5-mm 厚的切片，覆蓋以浸有固定劑的紗布或布料，並進行隔夜固定。
處理不佳的組織可能導致組織切片不完整，以及切片在水浴 (water bath) 中膨脹或崩解。包埋不正確的組織可能導致切片方向不良且不完整。微切片機 (microtome) 機構故障；刀片鬆動、鈍化或損壞；以及不準確的清除角 (clearance angles)，皆可能造成：
- 切片厚薄不均，
- 皺褶 (folds)（圖 2.4），
- 孔洞 (holes)（圖 2.5），
- 刻痕 (scores)（圖 2.6），
- 顫紋 (chatter)。
診斷性皮膚科切片檢查可為：
- 小型切取式 (small incisional)（削切 (shave)、芯取 (core)、打孔 (punch))，
- 切除性檢體 (excisional specimens)。
在送檢 (put-through) 之前，需要評估邊緣 (margins) 的切除性檢體應先以墨水標記 (inked)。若外科醫師已置入定位縫線 (localization sutures)，則通常適合採用四象限四色塗繪 (four-quadrant, four-color painting) 或兩色塗繪半側 (two-color painted halves)（圖 2.1）。削切式切片 (shave biopsies) 用於取樣或移除病灶，若大小適當，可分割成數段、二等分或三等分，並以邊緣朝向 (on edge) 包埋。對於諸如小型黑色素瘤 (melanoma) 等病灶的削切切除，邊緣包埋 (edge embedding) 至關重要，如此才能同時量化侵犯的寬度與深度。芯取或打孔切片 (core or punch biopsies) 直徑一般為 2–8 mm，其主要目的在於對較大病灶進行診斷性取樣。大於 4 mm 的切片應予以二等分，並將切面朝下進行包埋。二等分並切面朝下包埋可確保不會遺漏病灶。小於 4 mm 的切片則整個 (in toto) 送檢。
皮膚組織中存在鈣化區域與縫線，以及刀片上的缺口 (nicks)，可能導致切片出現顫紋 (chatter) 或在與刀緣成直角的方向上發生裂開。
圖 2-1：化膿性肉芽腫 (pyogenic granuloma) 的大體呈現 (A)，並對其下表面進行兩色塗繪 (B)。2-mm 厚的大體切片顯示送檢 (put-through) 時 (C) 與石蠟塊中 (D) 的黑色與藍色塗繪。圖片由南非 Durban 之 Africa Health Research Institute 的 K. Nargan 與 K. Lumamba 提供。
圖 2-2：流體傳輸型 (fluid-transfer type) 的自含式真空滲透組織處理機 (self-contained vacuum infiltration tissue processor)。
圖 2-3：微切片機 (microtome) 上含有皮膚組織（箭頭所示）的石蠟塊 (paraffin block)。
圖 2-4：技術性人工假象 (technical artifact)：因水浴漂浮技術不佳所造成的組織切片皺褶 (folds)。
圖 2-5：技術性人工假象：因切片過薄所造成的組織切片孔洞 (holes)。
圖 2-6：技術性人工假象：因微切片機刀片損壞所造成的組織切片垂直刻痕 (vertical scores)。圖片由南非 Durban 之 Africa Health Research Institute 的 K. Nargan 提供。