概述
- 免疫組織化學 (immunohistochemistry, IHC) 在許多中心已是臨床組織樣本最常用的輔助檢查。
- 以酵素作為標記，克服了免疫螢光 (immunofluorescence) 無法評估組織形態學的缺點。
- 標記系統演進:PAP → APAAP / ABC → 鏈黴親和素-生物素 (streptavidin-biotin)。後者因內源性生物素 (endogenous biotin) 造成背景染色,促使標記聚合物為基礎的偵測系統 (labeled polymer-based detection) 興起,適用手動與自動化平台。
IHC 方法分類
- 直接法 (direct):一級抗體直接接合標記,標記抗體直接與組織抗原反應。
- 兩步驟間接法 (indirect):標記二級抗體針對一級抗體來源動物的免疫球蛋白,顯示未標記的一級抗體。
- 三步驟 LSAB 法 (labeled streptavidin-biotin):
- 第一層 = 未接合的一級單株/多株抗體與組織抗原結合。
- 第二層 = 生物素化二級抗體(針對一級動物同物種)。
- 第三層 = 酵素標記鏈黴親和素,或酵素標記生物素-鏈黴親和素複合物。
- 酵素為 horseradish peroxidase 或 alkaline phosphatase,搭配呈色劑 (chromogen)。
- 呈色劑:過氧化酶法用 diaminobenzidine 或 3-amino-9 ethylcarbazole;鹼性磷酸酶-鏈黴親和素法用 indole reagents(紅)、naphthol fast red(紅)或 NBT/BCIP(藍)。
聚合物為基礎的方法
- EPOS(direct enhanced polymer one-step):約 70 個酵素分子 + 10 個一級抗體接合於 dextran 主鏈;單步驟完成,但僅限製造商專屬一級抗體。
- 其他 dextran 主鏈聚合物系統可附著多個酵素分子,適用手動與自動化 IHC。
- 優點:快速、可靠、可再現、靈敏度更高;可進行單色、雙色、三色與多色染色。
背景染色與疑難排解
- 背景染色成因眾多。單株抗體可減少非特異性背景;抗體濃縮液與預稀釋製劑須以正確稀釋度最佳化,稀釋液 pH 也是避免抗體變性與背景染色的關鍵。
- 親和素-生物素與 horseradish peroxidase 系統可能需生物素阻斷 (biotin blocking) 與內源性過氧化酶淬滅 (peroxidase quenching)。
- 聚合物系統可有效消除生物素誘發的偽陽性。
- 抗原修復 (antigen retrieval) 對抗原揭露關鍵,但須控制修復溶液 pH 與溫度及酵素消化;消化過久、溫度過高、沖洗不足會造成組織流失與背景染色。
偽陰性免疫染色
- 脫蠟不完全 (incomplete deparaffinization) → 抗體滲透不全 → 染色不佳。
- 過度消化 (overdigestion) → 破壞組織、抗原流失。
- 其他原因:試劑(含修復溶液)溫度不正確、抗體過期、稀釋度不當、抗體儲存不佳。
偽陽性免疫染色
- 呈色劑滯留 (chromogen entrapment)、沉澱、污染物可造成偽陽性。
- 呈色劑因對光熱敏感而分解、沖洗不足或呈色時間過長 → 背景泛色 (background blush);過濾呈色劑可防沉澱。
- 顫紋 (chatter)、撕裂、皺褶、切片附著不良 → 呈色劑滯留與沖洗不佳。
- 易發族群:厚角質層、真皮鈣化、硬化的切片;需細緻切片技術 (meticulous microtomy);未戴手套處理切片可致鱗屑 (squames) 污染。
圖 2-9:免疫組織化學技術 (A) 直接法、(B) 間接法、(C) 鏈黴親和素生物素法、(D) 聚合物鏈法。
Fig. 2.9 Immunohistochemical techniques (A) direct, (B) indirect, (C) streptavidin biotin, (D) polymer chain.
圖 2-13:技術性人工假象 p53 染色——因在 EDTA 緩衝液 (pH 8.0) 中錯誤地以過高溫度進行熱輔助微波抗原修復,造成切片皺縮與背景染色。
Fig. 2.13 Technical artifact p53 stain: wrinkling and background staining of tissue sections because of erroneously high temperature heat-assisted microwave antigen retrieval exposure of sections in EDTA buffer (pH 8.0).